Cellculture material

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세포배양실험 (cellculture material)

1.세포배양기기

 

CO2 incubator의 상태

1) 온도.... 보통 37℃

2) CO2 가스농도...보통 5%

3) 습도.... 90%이상

 

Clean bench

 

Clean bench는 상당히 위까지 열어도 좋지만, 얼굴이 바람이 와 닿는 정도로 열면, 작업 중에 눈에 건조해지며, 조금밖에 열지 않으면 클린벤치 내에 바람이 쉽게 빠져오지 못하므로, 턱 높이 정도까지 연다.

 

▷ 살균등을 켠 채로 작업하면?

 

배지를 흡입해낸 후의 세포에 직접 자외선이 닿으면, 짧은 시간이라도 DNA가 손상을 입어, 세포가 죽는다. Dish 뚜껑이나 배지를 통과하여 세포에 자외선이 미치는 경우는 없지만, 배지중의 성분이 분해·변질 될지도 모른다.

 

Autoclave

 

▶ autoclave 압력용기 바닥의 물량을 확인한다. 물량을 확인하는 센서는 물의 전도율을 인식하여 작동하므로 증류수인 경우 물이 없는 것으로 인식하므로 수돗물을 넣는다.

▶ 온도를 121℃로 설정하여 15분동안 작동시킨다.

 

2. 배지교환

 

배지색 (pH 지시약으로서의 phenol red ; pH 7.4일때의 색깔을 기억해 둔다.)

 

▶ 산성에서는 노랗게 된다.

·세포가 유산등을 분비하기 때문에 점차 노랗게 변한다.

·대사가 왕성한 세포는 배지가 빨리 노랗게 변한다.

·암세포는 정상세포보다 빨리 노랗게 변한다.

 

▶ 알칼리에서는 핑크색을 띤다

·탄산가스의 공급이 안될 경우.

 

배지의 관리

 

▶ 거품은 단백질을 변질시키므로 배지 중에 pipetting을 잘못해 공기를 뿜어내어 거품이 발생하지 않도록 한다.

 

▶ 세포가 자라고 있는 dish에 배지를 첨가하는데 사용한 피펫은 피셋 끝부분에 떠있는 세포나, 때로는 모르는 사이에 dish에 붙어있던 잡균이 묻어있을지도 모르므로 다시 medium 용기에 닿지 않도록 한다.

 

 

 

 

 

 

 

배지

배지의 종류

▷ EMEM (Eagle's minimum essential medium)

; primary mammalian cell과 human diploid cell에 적당.

 

▷ DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium)

; 다양한 포유동물 세포주 배양에 일반적으로 사용.

 

▷ Ham's F-12

; 원래 CHO (Chinese hamster ovary)세포 배양.

 

▷ IMDM(Isocove's modified Dulbecco's medium)

; 영양소가 많아서 고밀도 세포성장에 적당.

 

▷ Leibovitz's L-15

; 5% CO2를 공급하지 않고도 세포배양을 할 수 있도록 만들어졌다.

 

혈청(FBS or BCS)

 

▶ 세포 배양에 있어서 혈청의 역할

 

1) 세포의 성장과 기능에 관여하는 호르몬을 제공.

2) 세포의 부착과 확산인자 제공.

3) 호르몬, 중금속, 지질 등의 운반 단백질을 제공.

 

▶ 혈청의 종류

 

1) 우태혈청(FBS : fetal bovine serum) ; 보편적인 세포증식에 사용되는 혈청

2) 우아혈청(BCS : bovine calf serum) ; 우태혈청을 필요로하지 않는 몇몇 세포주 배양에 사용.

 

▶ 혈청의 성분

 

1) 단백질 ; 세포배양에 유용하다고 알려진 단백질로는 알부민과 글로불린, 세포부착을 촉진시키는 fibronectin, 트립신을 억제하는 a2-macroglobulin, 태아혈청내에 세포부착을 촉진시키는 fetuin, 철과 결합하여 독성이 덜하고 인체내에 유용한 transferrin등이 있다.

 

2) Polypeptide ; PDGF(platelet-derived growth factor)는 세포증식 촉진능력을 가지고 있는 polypeptide군 중 하나인데, 이것이 혈청내의 주용성장인자인 것으로 생각된다. PDGF는 섬유아세포와 신경교의 성장을 촉진한다. 그외 소량의 다른 polypeptide들이 있다.

 

3) 호르몬 ; 인슐린은 당과 아미노산의 세포내 섭취를 촉진하여 세포증식촉진을 나타낼 수 있고, IGF-1 수용체의 활성도에 의해서 그 효과를 나타낼 수도 있다. IGF-1과 IGF-2와 같은 성장인자는 인슐린 수용체와 결합할 뿐만 아니라, 인슐린이 결합할 수 있는 그들 자신의 독특한 수용체를 가지고 있어서 IGF-2의 경우는 세포의 당 섭취를 촉진시킨다. 또한 성장 호르몬은 특히 태아 혈청에 존재하는데, 이는 somatomedins(IGF)와 연계해서 세포증식을 촉진할 수 있다. 또한 우태혈청에서 그 양이 일정하지 않은 hydrocortisone은 세포의 부착과 증식을 촉진하는 기능이 있는데, 어떤 조건에서는 오히려 세포증식을 억제하고 세포분화를 유발하기도 한다.

 

4) 각종 영양소와 대사물질

5) 각종 무기물질

6) 억제인자

 

▶ 혈청의 비활성화(heat inactivation)

 

가장 많이 쓰이는 방법은 56℃에서 30분 동안 비활성화 하는 것이나, 적절하지 못한 열비활성화의 경우 미생물 오염으로 오인되는 침전물이 생기기도 한다.

 

배양에 사용하는 혈청 중에는 세포증식인자나 혈청 단백질 외에 체액성 면역을 담당하는 인자의 하나로 보체를 함유하고 있다. 다양한 보체 중에는 배양세포를 인식해서 세포독성을 나타내는 것이 함유되어 있어서 혈청을 그대로 배지에 넣어서 배양에 사용하면 세포증식이 억제되기도 하고, 죽기도 하는 일이 있다. 보체는 56℃에서 30분 정도 처리하는 것에 의해 활성을 잃어버린다.

 

3.세포계대

 

계대간격, Timimg 원칙

 

일반적으로, 정상에 가까운 세포에는 contact inhibiton의 성질이 있으므로, 이러한 성질을 유지하기 위해서는 dish에 가득하게 되기전에 혹은 가득하게 되면 곧바로 계대하는 것이 일반적이다. Concluent로 된 상태에서 계속 배양하면, confluent한 상태에서도 증식하는 세포가 점차로 증가하여 contact inhibiton의 성질이 없어지게 된다.

정상 섬유아세포와 같이 세포의 결합조직을 구성하는 단백질의 세포 간 기질인collagen등을 합성·분비하는 세포에서는, dish에 가득하게 세포가 자라면, 특히 세포의 결합조직을 구성하는 단백질의 합성·분비가 상승하기 때문에, trypsin등으로 세포를 분리시키는 것이 어렵게 되어, sheet 상으로 떨어질 뿐, 단세포의 현탁액으로 되지 않는다.

암세포는 그 정도로 신경을 쓰지 않아도 되는 것이 보통이지만, confluent하게 자란 것을 계속해서 배양하면, 세포가 중층으로 증식하기 때문에, 단일 세포로 분리하여 분산시키기 어렵게 된다. 따라서 너무 빽빽하게 증식하기 전에 계대하는 것이 좋다. 어떠한 경우든, 계대전날에 배지교환을 하여 세포를 원기 왕성하게 한 후에 계대하는 것이 바람직하다.

 

PBS(-)

 

NaCl을 넣어 등장용액으로 만든 인산완충용액(phosphate buffer)으로, Dulbecco's phosphate buffered saline(PBS)를 넣어 만든, 2가 이온이 들어가 있지 않은(Ca, Mg-free)것을 PBS(-)라고 한다. 세포끼리의 접착이나 세포와 기질과의 접착에는 칼슘을 매개로 이용하는 것들이 있기 때문에, 세포현탁액을 만들 때에는 PBS(-)로 세정한다. 30분 이상 현탁액으로서 보존할 때에는 배지를 이용하는 것이 좋다.

 

Trypsin/EDTA(PET)

 

배양용기벽에 부착하여 증식하는 세포를 계대하기 위해서는 세포와 세포간, 세포와 배양용기벽과의 접착을 떨어뜨려, 단일 세포로 된 현탁액(cell suspension)으로 만든 후, 이것을 희석하여 배양한다. 단백질에 의한 접착을 trypsin으로, 칼슘을 통한 결합을 EDTA로 파괴하여, 세포를 하나씩 분리한다. PET처리를 중지시키는데는 일반적으로 혈청이 들어가 있는 배지를 첨가시켜 행한다.

▷ 항온조에서 얼음을 녹일 경우 trypsin이 자기 소화하는 것을 피하기위해 빨리 항온조에서 꺼낸다.

 

▷ 차가운 상태로 용액을 사용할 경우, 차가운 용액이 세포에 닿으면, 세포가 배양용기에서 분리되는 경우가 있다. trypsin은 온도가 높을 때 효력을 잘 나타내지만, 37℃로 될 때 까지 기다리지 않아도 된다. 실온정도로 따뜻해졌을 때 사용하도록 한다.

 

 

 

 

세포수 계산

 

▶ 혈구계산판의 사용

 

혈구계산판을 수평으로 유지하여 주입하는 느낌이 아니라, 모세관 현상으로 계산판에 흡수 되도록 한다. 액체의 흡수속도가 너무 빠르면 세포가 미쳐 흡수되지 않아, 세포분포가 불균일하게 된다.

 

▶ 측정

 

cell의 농도가 높으면 카운트하기 어렵고, 너무 낮으면 정확하지 않으므로 1mm 네모 테두리 안에 대개 100개 정도의 세포가 있도록 농도를 조절한다. 적어도 4번 counting하며 측정결과가 ±10%이내에 들도록 한다.

 

생세포 counting (dye exclusion)

 

세포 현탁액을 만들었을 때 살아있는 세포(생세포)와 죽은 세포의 비율(생세포율), 혹은 살아있는 세포만의 수를 알고 싶은 경우가 있다. 생세포를 구별하는데 자주 사용되는 것으로 trypan blue를 이용한 색소배제법이 있다. trypan blue에 의해 푸르게 염색되어 있는 세포를 죽은 세포로 구분하여 counting한다. 살아있는 세포도 시간이 경과함에 따라 점차로 염색되기 때문에, trypan blue용액을 첨가하여 즉시 계산판에 넣어 계산한다.

 

세포현탁법

 

가능하면 큰 피셋으로 많은 양의 용액을 빨아들여 천천히 내뿜는 것에 의해 세포를 분산시킨다. 침전상태에 따라 다르지만, 비교적 단단한 경우에는, 소량의 배지를 첨가하여 우선 피펫으로 덩어리를 pipetting으로 현탁 하고, 다음에 필요량의 배지를 첨가하여 섞는 편이 낫다. 단단한 침전에 처음부터 많은 양의 용액을 첨가하면, 침전이 덩어리 채로 부유하여 덩어리가 분산되지 않기 때문이다.

 

분주방법

 

피펫으로 세포현탁액을 흡인하여 들인 다음, 빨리하지 않으면 피펫 내에서 점점 세포가 가라앉기 때문에, 용액의 위와 아래에서 세포 농도차가 생긴다. 반대로 용액을 떨어뜨리는 속도가 너무 빠르면, 세포가 미쳐 떨어지지 못하고 용액 위쪽에 세포가 모이게 된다. 적당하고, 일정한 속도로 세포 농도가 불균일하게 되지 않도록 떨어뜨리는 것에 익숙해지도록 하며, 피펫 내에서 농도차가 생겼다면, 원래의 현탁액에 되돌려 다시 흡인한다.

 

세포에 의한 conditioning

 

일반적으로, 세포는 배양 중에 각종 물질을 배지중에 분비하여, 결과적으로 배지를 자기자신에게 적합한 상태로 변화시키는데, 이것을 세포에 의한 conditioning이라고 한다. 많은 세포를 분주했을 때에는 conditioning이 빠르게 일어남으로 그것의 필요성을 알아차리지 못하는 경우가 많지만, 적은 수의 세포를 분주했을때는 신선한 배지에 conditioning medium을 반정도 섞으면 colony형성율이 높아지는 경우가 있다.

 

 

 

 

 

 

 

4. 세포동결보존

 

원칙적으로 세포분열 하는 세포 즉 증식성 세포를 동결보존 해야 한다. 동결보존 시 원칙적으로 세포분열 하는 세포 즉 증식성 세포를 사용하여야 하며 동결전 세포의 성장상태는 log phase(지수성장기)가 좋으므로 계대뱡양을 시행한지 2-4일 후 세포의 종류에 따라 적절한 시기에 동결보존 해야한다.

 

동결보존의 기본 원리

 

동결과정에서 생길 수 있는 세포손상의 원인은 다음과 같다.

 

1) 저온노출

 

동결에 의해서가 아닌 낮은 온도에 노출됨으로 인해 세포내의 기관과 기능에 장애가 발생하는 것이다. 이 손상은 냉각 속도에 영향을 받는데 냉각속도가 빠를수록 손상이 커지는 것으로 알려져 있다. 이런 상황 하에서 세포막 구조의 변화로 인한 반투과성의 변화가 발생할 수 있고 세포질의 수축이나 세포골격 요소의 응집 등의 형태학적 및 기능적 손상이 초래된다. 또한 uncoupling of respiration이나 carbohydrate conversion 대사과정의 손상 등 생화학적 생리적 변화가 발생한다.

2) 얼음결정형성에 의한 기계적 및 물리적 영향

 

세포가 동결배지 등에 현탁된 상태 즉 수용성 환경 하에서 동결 보존 시 온도가 천천히 내려가면 먼저 세포외액이 동결되기 시작하며 세포는 냉각은 되었지만 아직 얼지 않은 상태로 세포외액의 얼음 결정 내에 갇히게 된다. 온도가 계속 내려가면서 세포외액의 얼음 결정이 자라면 세포막이 기계적인 손상을 입을 수 있다. 얼음결정이 형성 될 때 얼음 결정 격자내의 전하를 띤 이온이 밖으로 빠져나와 세포외부의 잔존 액체에 축적되는데 이때 자라는 얼음 결정과 세포외액사이의 접촉영역에 전기장이 발생하고 (Workman-Reynolds effect) 세포막과 접촉 시 전위차가 일정 수준을 넘게 되면 세포막이 파괴되게 된다. 세포내 얼음결정은 각종 세포내 기관에 치명적인 손상을 입힌다. 동결 속도를 천천히 내리면 세포내 액이 세포 밖으로 충분히 유출되면서 세포내 얼음결정 형성 시간이 지연되고 얼음결정이 형성되더라도 육각형 얼음결정보다 크기가 작은 입방체를 이루게 되며 입방체 얼음결정은 세포내기관에 큰 손상을 입히지 않는 것으로 알려져 있다.

 

3) 세포외액 조성의 변화

4) 세포내액 조성의 변화

 

셋째, 넷째도 역시 동결 속도를 천천히 할 때 발생하는 것으로 먼저 세포외액이 동결되기 시작하고 얼음 결정 격자내의 용매가 밖으로 빠져나와 잔존 액체에 축적되어 세포외액이 고장액으로 변하게 된다. 이로 인한 세포막 내외의 삼투압 차이가 일정 수준을 벗어나면 세포막이 손상 받을 수 있고 그보다는 삼투압차이가 적은 경우 세포질내의 수분이 세포 외액으로 빠져나가 세포내외의 삼투압이 평형을 이루게 되면 세포내는 탈수 현상이 발생한다. 탈수 현상으로 세포질 내외는 고장액으로 변하게 되어 이로 인한 삼투압 스트레스가 세포에 손상을 초래한다. 또한 세포내 부피가 줄면서 세포막이 쭈그러드는데 이 경우에도 세포막의 손상이 발생할 수 있고 세포외액의 점도 변화나 pH 변화도 세포에 나쁜 영향을 줄 수 있다.

 

세포동결 용기(Cryovial)

 

세포동결 용기로서 1-1.8ml의 플라스틱 바이알을 가장 많이 사용한다. 용기의 부피가 커질 경우 동결배지에 현탁된 세포가 균질하지 않게 분포하게 되므로 작은 부피의 시료를 보관하는 것이 안전하다.

▷ 밀봉나사가 외부에 있는 것 ; 오염방지에 유리하나 내부로 액체질소가 유입될 경우 해동 시 폭발 위험이 더 크다.

▷ 밀봉나사가 내부에 있는 것 ; 밀봉고무가 존재하므로 바이알의 밀봉상태가 더 안전하다. 그러나 동결 전 밀봉고무가 젖어있을 경우 온도변화에 의한 팽창, 수축으로 오염될 위험이 있으므로 취급 시 특별히 조심해야한다.

 

동결보호제

 

세포동결보존 시 발생하는 손상으로부터 세포를 보호하기위한 또 하나의 방법이 동결보호제(cryoprotectants)를 동결배지에 넣어주는 것이다. 동결보호제의 역할은 세포외 액에 얼음 결정이 형성될 때 발생하는 삼투압 스트레스로 인한 세포 손상을 막아주고 세포에 치명적인 세포내 얼음 결정 형성을 억제하는데 있다.

 

▷ 동결보호제의 특징

 

1)세포막에 투과정이 좋아서 세포내로 들어가 지나친 동결건조를 예방하고 농축된 세포질내의 세포기관이나 생물학적으로 중요한 분자를 보호할 수 있어야하며 세포내 얼음 결정형성을 방지할 수 있다.

2)세포에 독성이 적어야한다.

3)용해도가 좋아야한다.

 

▷ 동결보호제의 종류

 

DMSO(dimethyl sulfoxide), glycerol, 1,2-propane-diol, sufrose, methanol, glucose, proline, galactose, lactose, glycine betaine, fructose 등이 있는데 DMSO나 glycerol을 가장 흔하게 사용한다.

 

동결배지

 

일반적으로 배양배지, 우태혈청(혹은 우혈청), 동결보호제를 포함한다. 조성은 대개 세포배양배지에 동결보호제(DMSO) 10%(v/v), 우태혈청 20-25%(v/v)를 첨가하여 사용한다.

 

동결기구

 

전자식 자동 세포 동결기(automatic cell freezer)를 사용하는 것이 제일 이상적이다. 이 기구가 없는 경우 isopropyl alcohol이 들어있는 동결용기속에 동결바이알을 넣고 -70℃에서 overnight 보관한 후 -196℃인 액체질소 용기에 이동 보관하면 된다. 동결 용기를 사용하면 대략 -1℃/min 속도로 온도가 떨어진다고 한다.

 

동결세포농도

 

세포의 동결-해동 과정에서 세포 생존율에 영향을 주는 또 다른 요인은 동결시키는 세포의 농도이다. 적혈구의 경우 세포농도가 높을수로 해동시 용혈 현상이 잘 일어나는 것으로 알려져 있으며 다른 종류의 세포에서도 cytocrit가 증가할수록 세포 생존율이 떨어지는 것으로 보고 되고 있다. 세포손상이 일어나는 cytocrit의 한계치는 대략 20% 정도인데 말초혈액 간세포(peripheral blood stem cell)의 경우 6×108cell/ml이 이에 해당되며 각질형성세포의 경우는 1×108cell/ml이 해당된다. 실제 동결보존을 할 경우는 2-5×106cell/ml로 동결시킨다.

 

세포의 동결보존방법

 

동결속도 -1℃/min 속도로 온도를 낮추며 동결보호제로는 10-15% DMSO나 glycerol을 사용해야하는 데 이보다 농도가 높을 경우 세포생존율이 감소하며 빠르게 동결시키거나 천천히 해동시킬 경우 가소정도가 더 커진다.

 

 

보관

 

동결과정이 이루어진 후 바이알은 -196℃ 액체 질소 용기에 보관해야한다. 동결세포가 장시간 가장 안전하게 보관될 수 있는 온도는 -130℃ 이하로서 일반적으로 초 저온 냉동고를 사용하여 보관할 경우 -70℃를 유지하게 되는데 이 온도에서는 세포내 물질대사가 완전히 멈춘상태가 아니므로 1개월이상의 장시간 보관은 불가능하다. -130℃이하의 온도에서는 물분자의 상변화가 완전히 정지하므로 거의 영구적으로 보관이 가능하다.

 

5.동결세포의 해동

 

해동 과정에서도 동결과정에서와 마찬가지의 기계적, 화학적, 물리적 영향을 받게 되는데 두 과정의 차이점은 처음 시작하는 세포의 상태에 있다. 동결과정의 경우 충분히 수화된 세포가 주변환경과 평형을 이룬 상태에서 자작하지만 해동 과정의 경우 동결건조상태이거나 세포내 얼음 결정이 존재하는 상태에서 자작하게 된다. 만약 해동과정이 천천히 이루어진다면 세포외액 으로부터 세포내로 수분이 유입되면서 세포내의 얼음 재결정화(recrystalization)현상이 발생하게 된다. 즉 해동 시 전체 얼음의 양은 감소하지만 재결정화 현상이 발생하며 이것은 세포에 치명적인 손상을 입히게 된다. 따라서 해동과정을 최대한 신속히 진행하여야 해동 후 세포 생존율이 증가할 수 있다. 일반적으로 액체질소 용기에서 동결바이알을 37℃ 수조로 옮겨 1분 내에 해동시킨다(1200℃/min).

 

해동속도는 액체질소에서 37℃ 수조로 동결바이알을 옮기는 방법으로 최대한 신속히 진행하여야(1200℃/min) 최대의 세포생존율을 얻을 수 있다.

 

 

 

Method

 

세포계대(Subculture)

 

Adhesion cell의 경우 - raw cell, L929 cell ect.

 

1. 배양용기에 있는 배지를 모두 흡입 제거한다.

2. calcium- and magnesium-free D-PBS로 1-2번 정도 washing한다.

3. trypsin-EDTA solution을 적당량 첨가하여 2-3분정도 incubation한다.

4. 바닥으로 부터 cell이 떨어지기 시작하면 serum-added medium을 첨가하여 trypsin-EDTA를 inhition시킨다.

5. tube에 위의 cell suspension을 옮긴 후 1500rpm에서 5분간 원심분리한다.

6. cell pellet만 남기고 위의 상층액은 모두 흡입제거한다.

7. fresh medium(serum-added medium)을 첨가하여 뭉쳐진 cell이 없도록 충분히 pipetting한 다음 새 배양용기에 각각 나누어 분주한다.

 

Suspension cell의 경우 - THP-1 cell, U937 cell ect.

 

1. 배양용기에 있는 cell을 conical tube로 옮긴 후 12000에서 800rpm정도에서 1분에서 2분간 centrifuge 해준다.

2. 배지를 suction한 다음 새로운 배지로 첨가하고 pipettetion 한다.

3. culture dish로 옮겨 키운다.

4. medium이 깨끗할 경우 앞의 1,2,3 과정 무시하고 그냥 medium첨가 후 계대한다.

 

 

 

 

 

세포의 동결보존(Freezing)

 

Adhesion cell의 경우 - raw cell, L929 cell ect.

 

1. 배양용기에 있는 배지를 모두 흡입 제거한다.

2. calcium- and magnesium-free D-PBS로 1-2번정도 washing한다.

3. trypsin-EDTA solution을 적당량 첨가하여 2-3분정도 incubation한다.

4. 바닥으로부터 cell이 떨어지기 시작하면 serum-added medium을 첨가하여 trypsin-EDTA를 inhition시킨다.

5. tube에 위의 cell suspension을 옮긴 후 1900rpm에서 2분간 원심분리한다.

6. cell pellet만 남기고 위의 상층액은 모두 suction 한다.

7. cell stock solution을 적당량 첨가하여 suspension한다.

8. 동결바이알에 1ml정도 각각 분주한 후 빨리 냉동실로 옮긴다.

9. cell은 냉동실에서 1-2시간정도 동결시키고, 70도 deep freezer에서 하루 둔 다음날 질소탱크로 옮겨 보관한다.

 

Suspension cell의 경우 - THP-1 cell, U937 cell ect.

1. cell suspendion을 옮긴 후 1900rpm에서 2분간 centrifuge한다.

2. 상층액을 suction한 다음 10%DMS인 FBS를 첨가한 후 동결 바이알에 1ml씩 옮긴다.

3. 스티로폼에 바이알을 넣고 deep freezer에서 하루 정도 둔다.

4. 질소탱크로 옮겨 보관한다.

* 동결시키는 cell의 density는 106cells/ml보다 높아야 한다.

 

 

 

 

동결세포의 해동(Thawing)

 

1. 앰플을 드라이아이스 용기에서 꺼낸후 37-40℃의 water bath에 넣는다.

2. 40-60초 동안 신속하게 녹인다.

3. 얼음이 녹자마자 수조에서 앰플을 꺼낸 후 상온의 70%알콜로 소독한다. 이 순간부터 무균작업대에서 작업을 실시한다.

4. 앰플뚜껑을 연다.

5. DMSO(dimethylsulfoxide)를 제거하기 위하여 15ml 튜브에 키우고자하는 배양액(10% FBS가 첨가된 RPMI1640 혹은 DMEM)을 10ml 정도 넣은 다음 앰플속의 세포부유액(1-1.5ml)을 옮긴다.

6. 1,900 rpm에서 2분간 원심분리한다.

7. 상층액을 제거한 후, 약 5ml의 배지에 cell pellet을 부유시킨다.

8. 배양용 플라스크(T25cm2)에 세포부유액(cell suspension)을 옮긴다.

9. 플라스크에 세포이름과 배양날짜 배지 등을 기입한다.

10. 5%의 CO2, 37℃의 배양기에서 배양한다.

11. 배지는 세포가 자라는 양상을 관찰하면서 교체한다. 즉, 바닥면적의 약 80%이상을 세포들이 차지하며 배지의 색깔이 변하면 배지의 약 80%정도를 교체해 준다. 12. 세포가 충분히 자랐을 경우, 필요에 따라 T75cm2플라스크에 옮긴다.

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